Jean ROSSIER
En neurobiologie, le début des années 70 a été marqué par une recherche très active sur les méthodes chimiques de localisation des voies neuronales. Les premiers progrès ont été obtenus par la localisation immunohistochimique des enzymes responsables de la biosynthèse des neurotransmetteurs. Dans ce domaine j'ai travaillé sur la localisation par immunohistochimie la choline acétyltransférase, le dernier enzyme de la voie biosynthétique de l'acétylcholine.
Pour ce travail de thèse fait sous la direction du Docteur Ph. Benda et du Professeur J. Glowinski au Collège de France dans le laboratoire de Jacques Monod, j'ai purifié la choline acétyltransférase du cerveau de rat. Malgré un facteur de purification (30.000 x) énorme pour l'époque, la préparation finale n'était pas pure. Les anticorps obtenus n'étaient pas monospécifiques et inutilisables pour des études immunohistochimiques fiables. Ce travail a permis à d'autres groupes d'obtenir de meilleures préparations et finalement des anticorps monoclonaux qui ont levé toute ambiguïté sur la localisation des voies cholinergiques. Aujourd'hui, nous utilisons ces méthodes immunohistochimiques pour caractériser les interneurones néocorticaux dont certains contiennent de la choline acétyltransférase.
En 1976, quand j'ai rejoint les laboratoires des Docteurs Bloom et Guillemin au Salk Institute, les morphines endogènes, enképhalines et ß-endorphine venaient d'être découvertes et il était généralement admis que la ß-endorphine, un long peptide de 31 acides aminés, était le précurseur des enképhalines (5 acides aminés). Mon travail a montré que cette vue générale de l'unicité des systèmes opioïdes était fausse; j'ai en effet montré que les neurones contenant la ß-endorphine avaient une distribution différente de ceux contenant les enképhalines. Plus tard, en continuant ce travail avec le groupe du Dr. Udenfriend au Roche Institute, j'ai montré que la ß-endorphine et les enképhalines provenaient de précurseurs différents. J'ai isolé de la médullo-surrénale du boeuf plusieurs longs peptides qui contenaient les séquences des enképhalines et non celle de la ß-endorphine. J'ai montré que, dans la proenképhaline, des peptides différents de la Met-et de la Leu-enképhaline avaient des rôles physiologiques importants. Ces peptides, heptapeptide Met-enképhaline-Arg6Phe7 et octapeptide Met-enképhaline- Arg6Gly7Leu8 sont co-libérés avec la Met- et la Leu-enképhaline. La découverte de ces peptides laissait penser que les systèmes opioïdes étaient complexes.
Mon travail avec F. Bloom a permis la localisation des neurones ß-endorphiniques. La principale voie neuronale (noyau arqué - substance grise périaqueductale) mise en évidence est importante dans le contrôle de la douleur. Avec Y. Hosobuchi nous avons montré que l'analgésie induite par stimulation électrique de cette voie s'accompagne de sécrétion intracérébrale de ß-endorphine.
Avec le docteur R. Guillemin, j'ai montré que le stress provoque une libération hypophysaire de ß-endorphine qui accompagne dans un rapport équimolaire la libération bien connue d'ACTH. Ce travail a été le premier à suggérer que l'ACTH et la ß-endorphine provenaient d'un précurseur commun la proopiomelanocortine (POMC).
Nos études sur les systèmes opioïdes de l'hypophyse avaient été les premières à suggérer que la neurohypophyse était contrôlée par une voie enképhalinergique dont l'origine est située dans les noyaux magno-cellulaires de l'hypothalamus. Avec J.-J. Vanderhaeghen de Bruxelles, nous avons montré que dans ces noyaux les enképhalines étaient co-localisées avec l'oxytocine et confirmé la présence de peptides dérivés de la prodynorphine dans les neurones vasopressinergiques.
L'étude des mécanismes impliqués dans la biosynthèse des enképhalines a montré que la maturation de la proenképhaline se fait lors de son transport axonal. Nous avons observé qu'une séquence importante, constituée par les 70 acides aminés N-terminaux du précurseur, n'est pas détruite durant la maturation de la proenképhaline. Ce peptide a été appelé synenképhaline, le préfixe « syn », provenant de la racine grecque "avec", indique que cette molécule accompagne les enképhalines pendant leurs synthèse, transport et libération. Une fois libérée, la synenképhaline se montre beaucoup plus résistante à la dégradation que les enképhalines.
D'autres études ont montré que le processus de maturation des précurseurs n'était pas unique et qu'un même précurseur pouvait donner des produits différents selon les tissus. Ce phénomène est important. Il permet d'obtenir à partir d'un seul précurseur un grand nombre de neuropeptides différents.
A mon retour des USA, le professeur Robert Naquet m'a offert la direction d'une unité de neuropharmacologie au laboratoire de physiologie nerveuse qu'il avait créé au CNRS à Gif sur Yvette. Robert Naquet (1922-2005), spécialiste de l'épilepsie, avait été le premier à découvrir les propriétés anti-convulsivantes des benzodiazépines. Ces molécules en se fixant sur le récepteur GABA-Benzodiazépine potentialisent l'effet du GABA, le neuromédiateur de l'inhibition dans le système nerveux central. Le travail du laboratoire a été centré sur les antagonistes des benzodiazépines. Les molécules étudiées, le Ro 15-1788 et la méthyl-β-carboline, bloquent les effets des benzodiazépines en les déplaçant de leur site de liaison. Ces deux antagonistes ont cependant des propriétés différentes. Le Ro 15-1788 est un antagoniste dépourvu de propriétés intrinsèques. La méthyl-β-carboline a des propriétés intrinsèques et, administrée seule, provoque des convulsions et chez l'homme des crises d'angoisse. Les propriétés de la méthyl-β-carboline sont donc inverses de celles des benzodiazépines classiques qui sont anticonvulsivantes et anxiolytiques. Un ensemble de travaux de différents laboratoires et du nôtre ont permis de formuler les deux conclusions suivantes:
Il était généralement admis que les ligands des récepteurs étaient soit des agonistes, soit des antagonistes, soit des agonistes partiels. Cette classification de la pharmacologie classique n'était plus valable, et nos travaux ont contribué à l'établissement de concept de l'agoniste inverse proposé par W. Haefely à Bâle dans les années 80. Ainsi la liaison d'un agoniste benzodiazépinique au récepteur GABA va faciliter la transmission GABA-ergique alors qu'un agoniste inverse aura l'effet opposé. Les agonistes et les agonistes inverses se fixent sur le même site du récepteur GABA et engendrent des réponses différentes et opposées.
Le principal effet indésirable des benzodiazépines est de provoquer une amnésie antérograde qui peut parfois être très importante. Au laboratoire, nous avons montré que la méthyl-β-carboline avait un effet opposé. Chez la souris, la méthyl-β-carboline administrée avant la période d'apprentissage augmente les performances des animaux lors de la séance de rappel. De faibles doses de méthyl-β-carboline ont un effet facilitateur sur l'apprentissage.
Depuis nos travaux publiés en 1986, la biologie moléculaire du récepteur GABA a montré que celui-ci était constitué de plusieurs sous-unités nommées α, β et γ. Les sous-unités α se décomposent sous 5 isoformes. La sous-unité α5 est présente principalement dans l'hippocampe, une région du cerveau impliquée dans l'apprentissage et la mémoire. Ces observations faisant suite aux nôtres ont été à la base du développement par plusieurs firmes pharmaceutiques d'agonistes inverses spécifiques de la sous-unité α5. Ces molécules n'agissant pas sur les sous-unités α1 et α2 n'avaient pas d'effet convulsivant ni anxiogène par contre elles augmentaient spécifiquement les performances des animaux dans des tâches d'apprentissage et de mémoire. Ces agonistes inverses spéciques des sous-unités α5 ont maintenant fait l'objet d'études cliniques phase 1, 2 et même 3 chez l'homme avec comme application le traitement des troubles cognitifs dans les maladies neurodégénératives. La fermeture du principal centre de recherche pharmaceutique étudiant ces molécules (Merck Sharp Dohme, Terling UK) a porté un coup d'arrêt à ce programme qui semblait très prometteur. Nous espérons qu'il sera repris.
Les récepteurs des acides aminés excitateurs couplés à des canaux ioniques sont groupés en trois classes: les récepteurs NMDA, kaïnate et AMPA. Ces récepteurs sont formés par l'assemblage de plusieurs sous-unités dont les gènes ont été identifiés. Pour le récepteur AMPA, quatre gènes codant pour des sous-unités différentes GluR1 à GluR4 ont été clonés. La variété des sous-unités est augmentée par des variants d'épissage et d'édition et, en théorie, près de cent mille assemblages différents pourraient exister. La présence de certaines sous-unités modifie profondément les propriétés du récepteur AMPA. Il apparaît donc important de déterminer les principaux assemblages existant réellement dans le cerveau. Dans ce but, Bertrand Lambolez, un étudiant de mon groupe a mis au point une technique associant le patch-clamp et la RT-PCR. Cette technique est maintenant utilisée dans de nombreux laboratoires y compris celui du professeur Bert Sakmann, (prix Nobel 1991) l'inventeur de l'enregistrement électrophysiologique par « patch-clamp » avec Erwin Neher.
Cette nouvelle méthode permet d'étudier les propriétés électrophysiologiques et les caractéristiques biochimiques d'une même cellule. La cellule est enregistrée en patch-clamp dans la configuration "cellule entière". Les propriétés électrophysiologiques et pharmacologiques du récepteur sont analysées. Ensuite le cytoplasme de la cellule enregistrée est aspiré et les ARN messagers sont transformés en ADN complémentaires par la transcriptase inverse. Les fragments d'ADN complémentaires correspondants aux sous-unités des récepteurs sont amplifiés par la réaction de polymérase en chaîne (PCR). Pour cette réaction nous choisissons des amorces qui permettent d'amplifier simultanément et proportionnellement les ADN complémentaires correspondant à toutes les sous-unités d'une classe de récepteur. Les fragments amplifiés sont ensuite identifiés par digestion avec des enzymes de restriction.
Cette méthode a été utilisée pour étudier la perméabilité calcique particulière d'un récepteur AMPA, qui a pu être expliquée par la composition en sous-unités. Cette méthode a également été utilisée pour étudier la composition en sous-unités des récepteurs NMDA et kaïnate. Cette méthode permet aussi d'étudier à l'échelle d'une cellule unique, la présence de variants d'épissage et d'édition.
La cellule est construite autour d'un cytosquelette formé par un réseau microtubulaire dont les tubulines sont les principaux constituants protéiques. En 1990, nous avons mis en évidence dans le cerveau une nouvelle modification posttraductionnelle des tubulines. Il s'agit de l'addition de plusieurs résidus glutamyls branchés sur un glutamate de la chaîne principale. Cette addition se fait par un branchement sur la fonction gamma carboxylique du glutamate 445 de la tubuline &alpha. Cette modification a été retrouvée sur la tubuline ß avec un branchement sur le glutamate en position 438.
En fait, sur 95% des tubulines α et ß du cerveau, un à huit glutamates sont ajoutés post-traductionnellement à la tubuline. Pour ce travail, l'apport de la spectrométrie de masse a été essentiel et nous avons développé l'utilisation de cette technique en chimie des protéines afin d'étudier le protéome de divers tissus.
En examinant les tubulines des axonèmes des cils de paramécie, nous avons découvert une nouvelle modification post-traductionnelle, la polyglycylation. Il s'agit de l'addition de trois à quarante résidus glycyls branchés sur un glutamate de la chaîne principale de la tubuline. Nous avons maintenant retrouvé ces modifications chimiques dans les axonèmes des cils et des flagelles d'autres espèces y compris l'espèce humaine.
La diversité des formes moléculaires des tubulines n'est pas seulement due à ces modifications post-traductionnelles mais aussi à l'existence d'une famille de gènes de tubuline, récemment démontrée par les programmes de séquençage. Certaines de ces nouvelles tubulines que nous avons découvertes avec Pascale Dupuis-Williams ont des fonctions spécialisées dans la construction des centrioles et des corps basaux.
Depuis le début de ma carrière scientifique, j'ai suivi une ligne de recherche centrée sur l'étude des fonctions du cerveau et de sa pharmacologie. Le cerveau est un organe très complexe composé de milliards de neurones de types très différents. Chaque neurone du cerveau est en contact avec des milliers d'autres et ces jonctions elles-mêmes caractérisent l'unicité du neurone étudié ; de même, le patron d'expression d'un ensemble de gènes est spécifique d'un type de neurone. Parmi les 25 000 gènes de notre patrimoine génétique, plusieurs centaines vont déterminer à un instant donné le caractère d'un neurone et sa clé dans l'utilisation d'un code neuronal. Le décryptage du programme et du contenu d'un neurone et l'analyse de son rôle au sein du réseau neuronal du cortex cérébral in vitro et in vivo a constitué l'objectif des recherches de mon groupe depuis 1995.
Mon laboratoire s'intéresse particulièrement à l'organisation du néocortex, cette partie du cerveau qui est la plus impliquée dans l'émergence des activités cognitives. La complexité du réseau néocortical composé d'une population particulièrement hétérogène de neurones et de cellules gliales a amené mon groupe de recherche à inventer une nouvelle méthode d'étude de cette diversité cellulaire : la RT-PCR sur cellule unique après patch-clamp, technique décrite précédemment. Avec le développement de la multiplex RT-PCR au laboratoire par Bruno Cauli, l'expression d'une centaine de gènes différents peut être analysée simultanément. Nous avons depuis trois ans entamé avec Marie-Claude Potier un programme de recherche important sur les puces à ADN (DNA arrays) couplées à la microfluidique dans le but de pouvoir un jour analyser avec fiabilité l'ensemble du transcriptome d'une seule cellule. Mon groupe de recherche travaille également sur les techniques les plus modernes de miniaturisation de l'analyse par spectrométrie de masse afin de pouvoir également identifier dans le cytoplasme d'une cellule unique les neuropeptides, les neuromédiateurs et les seconds messagers. Ces analyses du transcriptome et du métabolome à l'échelle de la cellule unique sont un défi technologique qu'il faut résoudre afin de pouvoir déchiffrer le code neuronal et de comprendre l'organisation des réseaux neuronaux. Toute cette approche analytique est soutenue par ce credo bien connu des anatomistes : la connaissance du contenu d'une cellule est une aide précieuse pour en étudier la fonction.
Le développement des techniques ultrasensibles décrites ci-dessus a permis de mieux comprendre l'organisation du néocortex et en particulier le rôle des interneurones GABAergiques connus pour leur rôle dans le contrôle de l'excitabilité cérébrale. Le travail mené depuis dix ans a montré que les interneurones du cortex présentent une diversité extrême. Depuis Cajal (prix Nobel 1906), on savait que les interneurones possédaient une anatomie très variée. Au laboratoire, nous avons montré que leur transcriptome est également très varié. Cette diversité au niveau de l'expression des gènes a pu être associée avec différentes propriétés fonctionnelles.
Ainsi des interneurones se comportent comme des détecteurs de coïncidence et sont importants dans la genèse des rythmes électriques corticaux. Ils représentent également la principale source de transmission inhibitrice sur les cellules pyramidales. Leur implication dans les manifestations épileptiques et l'anxiété fait partie des hypothèses que nous sommes en train de valider.
Une autre classe d'interneurones qui semble être importante dans les toxicomanies a été caractérisée. Ces neurones possèdent à la fois des récepteurs opiacés, nicotiniques et cannabinoïdes. Ils se projettent sur les cellules pyramidales. Les expériences faites actuellement montrent que dans les mécanismes de la dépendance au tabac et aux morphiniques, ces interneurones joueraient un rôle primordial dans les modifications des propriétés d'intégration corticale.
D'autres classes d'interneurones contrôlent le métabolisme cérébral et la perfusion cérébro-vasculaire. Ces diverses classes d'interneurones contiennent les neuropeptides VIP, Somatostatine et NPY, ce dernier accompagné dans les interneurones « neurogliaform » de l'enzyme NOS fabriquant le monoxide d'azote. Certains interneurones contractent, d'autres dilatent les artérioles cérébrales. Le travail actuel du laboratoire montre donc que ces différents interneurones seraient un relais essentiel dans l'augmentation de la perfusion cérébrale locale qui suit après quelques secondes l'augmentation de l'activité cérébrale. Cette augmentation de la perfusion locale est visualisée par les techniques d'imagerie fonctionnelle fMRI ou PET. Malgré l'importance de l'imagerie fonctionnelle dans les neurosciences, la neurologie et la psychiatrie, le mécanisme physiologique qui sous-tend l'augmentation de la perfusion locale en réponse à un stimulus est encore totalement inconnu. Notre approche actuelle proposant un rôle important de relais aux interneurones est originale et reconnue comme telle par nos collègues qui nous invitent à donner des conférences plénières.
Un dernier mot sur l'importance actuelle de nos travaux sur le contrôle de la perfusion locale cérébro-vasculaire. Dans la physiopathologie des maladies neurodégénératives tel la maladie d'Alzheimer les réponses fonctionnelles à des épreuves d'activation cérébrales sont diminuées voire abolies. Ceci est à mettre en rapport avec la diminution du nombre de projections des interneurones contenant les neuropeptides sur les vaisseaux cérébraux dans ces maladies. Notre travail sur les interneurones pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques.